Studie: Wie reagieren Zellen der Mundhöhle auf unterschiedliche Zahnpasten?

Die menschliche Mundhöhle wird von 3 unterschiedlichen Arten von Mundschleimhaut ausgekleidet und steht im direkten Kontakt zur Außenwelt. Während die auskleidende Mundschleimhaut, ein bis zu 0,5 mm dickes, unverhorntes Plattenepithel, den weichen Gaumen, die Zungenunterseite, den Mundboden, die Alveolarfortsätze, die Wangen- sowie die Lippeninnenseite überzieht, findet man die mastikatorische Mundschleimhaut als ungefähr 0,25 mm dickes, verhorntes Plattenepithel am harten Gaumen und im Gingivabereich. Die spezialisierte Schleimhaut überzieht Papillen, die für die Geschmackswahrnehmung an der Zungenoberfläche zuständig sind.

Zudem werden auch Tast- und Temperaturempfindungen wahrgenommen. Gemein ist allen 3 Arten eine starke Innervation, eine gute Durchblutung sowie eine hohe physiologische Zellerneuerungsrate. Dank dieser Eigenschaften ist die mit der Mundschleimhaut ausgekleidete Mundhöhle bestens für ihre Aufgaben als direkte Kontaktstelle mit der Außenwelt gerüstet.

In diesem 1. Teil des Verdauungssystems wird die zugeführte Nahrung nicht nur mechanisch zerkleinert und mit Speichel durchmischt, sondern auch durch vorhandene Enzyme bereits aufgespaltet. Dieser Prozess beansprucht durch die ständige Zufuhr von körperfremden Substanzen von außen eine sehr potente, lokal aktive Immunabwehr [1,2].

Inhaltsstoffe sollten gegenüber Mundschleimhaut unbedenklich sein

Die Mundschleimhaut in ihrer Gesamtheit stellt eine wichtige Barriere gegenüber schädlichen Substanzen und Krankheitserregern dar, wobei aber gleichzeitig ein Austausch mit der Außenwelt stattfinden kann. Zu bedenken ist diese einzigartige Schnittstelle zwischen Körperinnerem und Außenwelt auch bei der täglichen Körper- und insbesondere Zahnpflege. So treten die Inhaltsstoffe von Pflegeprodukten, die intraoral angewendet werden, wie z.B. von Zahnpasten, in den direkten Kontakt mit der Mundschleimhaut und können somit auch auf diese einwirken.

Demzufolge dürfen bei der Entwicklung von Zahnpasten nicht nur die Effektivität bezüglich ihrer Reinigungsfunktion der Zähne und die Auswirkungen auf den Biofilm beachtet werden; auch der Einfluss der Inhaltsstoffe auf die Mundschleimhaut muss untersucht und dessen Unbedenklichkeit festgestellt werden [1,2].

Kariesprophylaxe: Additive Stoffe zu Fluoriden gesucht

Die Aufgaben einer Zahnpasta im Kampf gegen Karies und Parodontopathien sind klar definiert und werden von den meisten sich am Markt befindlichen Zahnpasten auch erfüllt: Der täglich anwachsende Biofilm soll mithilfe von geeigneten Zahnbürsten und Zahnpasten entfernt und eine altersgerechte Menge von Fluorid bereitgestellt werden. Jedoch ist die ebenso wichtige Verträglichkeit der Zahnpasten für die Mundschleimhaut nicht bei allen Produkten gegeben und bedarf noch weiterer Forschung und Entwicklung [3].

Zudem sollten auch neue Inhaltsstoffe für eine zusätzliche Wirksamkeit gegen Karies entwickelt und getestet werden. Diese könnten insbesondere additiv zum Fluorid Anwendung finden.

In bisherigen Studien als interessant herausgestellt haben sich zu diesem Zweck natürlich vorkommende Zuckeralkohole, wie Erythritol und Xylitol, die momentan hauptsächlich als Zuckeraustauschstoffe in der Nahrungsmittelindustrie Verwendung finden. Diese beiden Stoffe zeigten in Studien neben ihrer indirekten karieshemmenden Wirkung durch die Zuckersubstitution auch eine direkte hemmende Wirkung auf die Biofilmbildung, eine Reduktion von kariesverursachenden Bakterien und somit eine Reduktion der Kariesanfälligkeit der Studienteilnehmer.

Da Erythritol und Xylitol als natürlich vorkommende Zuckeralkohole bereits in der Lebensmittelindustrie eingesetzt sind, ist zunächst anzunehmen, dass sie als Inhaltsstoffe von Zahnpasten unbedenklich sind [4,5]. Dennoch bedarf es genauer Untersuchungen, wie Zellen der Mundschleimhaut auf Zahnpasten mit neuen Inhaltsstoffen reagieren.

Viel diskutierter Inhaltsstoff: Natriumlaurylsulfat 

Ein Inhaltsstoff, der bereits in vielen Zahnpasten vorkommt und auch bereits in diversen Studien untersucht wurde, ist Natriumlaurylsulfat (Englisch: sodium lauryl sulfate [SLS]). Als Tensid bewirkt Natriumlaurylsulfat durch seine schäumende Wirkung eine gute Verteilung der Zahnpasta in der Mundhöhle und zudem eine Reinigung, da es durch gleichzeitig auftretende hydrophile und hydrophobe Eigenschaften die Oberflächenspannung herabsetzt.

Da Natriumlaurylsulfat zu den preiswerteren Tensiden gehört, ist es in der Industrie und damit auch als Inhaltsstoff in Zahnpasten weitverbreitet. Zu bedenken ist jedoch, dass Natriumlaurylsulfat als Inhaltsstoff für Mundhygieneprodukte nicht ganz unproblematisch ist und bereits heute einige Hersteller, insbesondere bei den Kinderzahnpasten, auf alternative Stoffe zurückgreifen. Neben In-vitro-Studien, die Natriumlaurylsulfat untersuchten, gibt es auch klinische Berichte über ein häufigeres und langwierigeres Auftreten von ulzerativen Aphthen bei Verwendung von Natriumlaurylsulfat-haltigen Zahnpasten [6-10].

In der vorliegenden Arbeit wird eine neu formulierte fluoridhaltige Zahnpasta (AirFlow/KALAfresh-AF; Dr. Wittmann GmbH & Co.KG, Zwingenberg, Deutschland) bezüglich ihrer Wirkung auf Zellen der Mundschleimhaut untersucht. Die Zahnpasta enthält für additiven Kariesschutz Erythritol und Xylitol; sie beinhaltet kein Natriumlaurylsulfat. Als Kontrolle wurden 4 fluoridhaltige Zahnpasten gewählt, die sich schon länger am Markt befinden, wobei 3 dieser Zahnpasten Natriumlaurylsulfat als Tensid beinhalten und eine Zahnpasten kein Natriumlaurylsulfat aufweist.

Material und Methoden

Detaillierte Informationen zu Material und Methoden sind in der Originalarbeit „The Biocompatibility of a New Erythritol- and Xylitol-Containing Fluoride Toothpaste“ der Autoren [11] nachzulesen und wurden zum Teil 2019 auch im Rahmen des CEDIADR-(Continental European Division of the International Association for Dental Research) Kongresses in Madrid präsentiert. Die für die vorliegende Arbeit untersuchten Zahnpasten sind in Tabelle 1 mit Herstellerfirmen, beigemengtem Tensid und angegebenem Fluoridgehalt aufgelistet.

Tab. 1: Namen, Hersteller, Tenside und angegebener Fluoridgehalt der untersuchten Zahnpasten.

Herstellung des Zahnpasten-Slurrys

Eine Mischung aus Zahnpasta und einer Flüssigkeit, ein „Zahnpastenslurry“, wurde hergestellt, um die natürlich vorkommende Durchmischung mit Speichel während des Zahnputzvorganges zu simulieren. Dafür wurde die jeweilige Zahnpasta in einem für die Zellkultur üblichen serumfreien Medium (Dulbecco‘s Modified Eagle Medium DMEM, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) mit 50% w/v (weight per volume) verdünnt.

Um die festen Bestandteile des Slurrys zu entfernen und das daraus resultierende Zahnpasten-Konditionierungsmedium (toothpaste-conditioned medium [TCM]) für die Zellversuche zu gewinnen, wurde der Slurry zentrifugiert und abschließend filtersterilisiert.  Zur genauen Ermittlung der halbletalen Konzentration wurde das gewonnene Zahnpasten-Konditionierungsmedium mit 50% w/v in einer 1:2 Verdünnungsreihe weiterverdünnt bis zu einer Konzentration von 0,8% w/v.

Halbletale Konzentration und Proliferationsverhalten

Schleimhautzellen der Mundhöhle (Gingivafibroblasten [GF]) und parodontale Ligamentzellen [PDL]) kommen bei der täglichen Zahnreinigung direkt mit der Zahnpaste in Kontakt. Daher wurden diese Schleimhautzellen sowie Mäusefibroblasten (L929), als eine häufig bei Zytotoxizitätstests eingesetzte Zelllinie, in der vorliegenden Arbeit mit unterschiedlichen Konzentrationen Zahnpasten-Konditionierungsmedium stimuliert, um die für jede Zahnpasta halbletale (halbtödliche) Konzentration zu errechnen.

Diese entspricht der Konzentration bzw. dem Verdünnungsstand der Zahnpasta, bei welcher die Hälfte der damit in Kontakt kommenden Zellen vital bleibt und die andere Hälfte abstirbt. Zudem wurde das Proliferationsverhalten der Zellen analysiert, nachdem sie den jeweiligen Zahnpasten ausgesetzt waren. Es kann so eine Aussage getroffen werden, ob sich die Zellen nach Kontakt mit unterschiedlichen Zahnpastenslurry-Konzentrationen weiter vermehren.

Ergebnisse

Halbletale Konzentration

Lussi

Die Konzentrationen der 5 untersuchten Zahnpasten, bei denen die Hälfte der untersuchten Zellen vital bleibt und die andere Hälfte abstirbt (halbletale Konzentration [LC50]) sind für die Mäusefibroblastenzelllinie (L929) in Abbildung 1 und für die Zellen der Mundschleimhaut (Gingivafibroblasten [GF]) und parodontale Ligamentzellen [PDL]) in den Abbildungen 2 (GF) und 3 (PDL) dargestellt. Nach statistischer Auswertung zeigte sich, dass die neue Zahnpaste AirFlow/KALAfresh (AF) signifikant höhere LC50-Werte aufwies als die Kontrollzahnpasten Oral-B Repair (OB), Odol Med3 Classic (OM) und Sensodyne Repair (Se). Im Vergleich zu der Kontrollzahnpaste Zendium Complete Protection (Ze) zeigte sich kein statistisch signifikanter Effekt.

Lussi

Lussi

Proliferationsverhalten

Um das Proliferationsverhalten der Zellen nach Kontakt mit der jeweiligen Zahnpasta zu untersuchen, wurden L929-Zellen mit Zahnpastenslurrys unterschiedlicher Konzentration für 2 Minuten stimuliert und anschließend untersucht. Es zeigte sich, dass die Zellen nach Stimulation mit einem 6-w/v%-Slurry bei AirFlow/KALAfresh eine Proliferationsrate im Vergleich zu unbehandelten Zellen von mehr als 80% erreichten. Bei allen anderen Zahnpasten blieb die Proliferationsrate unter 26%.

Bei einer Inkubation mit einem 3%igen Zahnpasten-Konditionierungsmedium erreichten die Zellen, wenn sie mit AirFlow/KALAfresh (AF) stimuliert wurden, bereits ein unbeeinträchtigtes Proliferationsverhalten. Dahingegen war das Proliferationsverhalten der Zellen nach Stimulation mit den anderen Zahnpasten – Oral-B Repair (OB), Odol Med3 Classic (OM), Sensodyne Repair (Se) und Zendium Complete Protection (Ze) – noch stark gehemmt. Die Daten zu den Versuchen zum Proliferationsverhalten sind in Tabelle 2 angegeben.

Tab. 2: Proliferationsverhalten in % im Vergleich zu unbehandelten L929-Fibroblasten nach Stimulation mit verschiedenen Konzentrationen von Zahnpasta-Konditionierungsmedium (TCM). Zu beachten sind die großen Unterschiede.

Diskussion

Die Mundhöhle als Eintrittspforte für Nahrungsmittel und Getränke ist durch verschiedene Mechanismen auf zellulärer Ebene und auch durch den kontinuierlichen Speichelfluss sowie die Pellikel als biologische Barriere gut geschützt [1]. Nichtsdestotrotz sollten neu entwickelte Produkte, die in der Mundhöhle Anwendung finden, wie Zahnpasten, nicht nur auf ihre Effektivität, sondern auch auf ihren Einfluss auf die Zellen der Mundschleimhaut getestet werden.

Zu diesem Zweck wurden in der vorliegenden Arbeit die Auswirkungen einer neu entwickelten Zahnpasta (AirFlow/KALAfresh-AF) auf Zellen der Mundschleimhaut und auf eine in Zytotoxizitätsversuchen häufig verwendete Zelllinie untersucht. Als Kontrolle dienten, wie oben beschrieben, vier kommerziell erhältliche Zahnpasten. Alle untersuchten Zahnpasten enthalten als Schutz vor Karies Fluorid, eine conditio sine qua non in der heutigen Zahnmedizin.

Der Unterschied in den Zahnpasten liegt einerseits in der zusätzlichen Beimengung von weiteren kariesprotektiven Substanzen, Erythritol und Xylit, in der neu entwickelten Zahnpaste und in der Wahl des Tensides zur Schaumbildung und Herabsetzung der Oberflächenspannung. Während 3 der kommerziell erhältlichen Zahnpasten (OM, OB und Se) Natriumlaurylsulfat als Tensid beinhalten, greifen die Hersteller der 4. kommerziell erhältlichen Zahnpasta auf ein alternatives Tensid, Steareth-30, zurück. Auch die neu entwickelte Zahnpasta AF enthält kein Natriumlaurylsulfat, sondern Natrium (C14-16) Olefin-Sulfonat als wirksames Tensid.

Hinsichtlich der Auswirkungen der jeweiligen Zahnpasta, beziehungsweise des aus der jeweiligen Zahnpaste gewonnenen Zahnpasta-Konditionierungsmediums (TCM), auf die untersuchten Zellen zeigte sich, dass beide Zahnpasten ohne Natriumlaurylsulfat deutlich bessere Werte erzielten als die 3 Zahnpasten mit Natriumlaurylsulfat als Tensid. So zeigte die Zahnpaste AF statistisch signifikant deutlich höhere Werte der halbletalen Konzentration (LC50-Werte) als die 3 Zahnpasten mit Natriumlaurylsulfat (OB, OM und Se). Das bedeutet, dass AF in den durchgeführten Experimenten weniger zellschädlich war als die 3 Vergleichszahnpasten.

Die 4. kommerziell erhältliche Zahnpasta (Ze), bei der ebenfalls ein alternatives Tensid zum Einsatz kommt, bestätigt die Hypothese, dass Natriumlaurylsulfat für die geringeren LC50-Werte verantwortlich zu sein scheint, da ebenfalls höhere und somit für die Zellen verträglichere LC50-Werte nachgewiesen werden konnten. Bei der Analyse des Proliferationsverhaltens der Zellen nach Stimulation mit dem jeweiligen TCM zeigte sich ebenfalls eine Überlegenheit der Zahnpaste AF gegenüber den Zahnpasten OB, OM und Se, sodass die Untersuchungsergebnisse mit denen der halbletalen Konzentrationen korrelieren. Die mit AF-TCM stimulierten Zellen wiesen nach der Behandlung ein höheres Proliferationsverhalten auf als die Zellen, die mit TCM der Natriumlaurylsulfat-haltigen Zahnpasten stimuliert wurden.

Aber auch im Vergleich zu der kommerziell erhältlichen Natriumlaurylsulfatfreien Zahnpasta zeigten AF-stimulierte Zellen mit 87% Zellproliferation ein deutlich höheres Proliferationsverhalten als Ze-stimulierte Zellen mit 26%. Warum dies so ist, kann aufgrund der vorliegenden Experimente nicht gesagt werden und bedarf weiterer Untersuchungen.

Jedoch könnte das aus primär kariesprotektiven Gründen zugesetzte Erythritol eine nicht zu unterschätzende Rolle hierbei spielen. So zeigte Erythritol in verschiedenen Studien membran- und zellschützende Eigenschaften.

Fazit

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die neu entwickelte Zahnpaste AirFlow/KALAfresh eine sehr gute Verträglichkeit für die untersuchten Zellen der Mundschleimhaut aufweist. Insbesondere Konsumenten, die zu Aphthen neigen, kann die Zahnpasta empfohlen werden, denn sie enthält kein Natriumlaurylsulfat (SLS). SLS kann die Entstehung von Aphthen begünstigen.

Näheres zu den Autoren des Fachbeitrages: Imov.-Prof. Barbara Cvikl, Prof. Dr. Adrian Lussi

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